Wstępne wyniki zastosowania techniki interferencji RNA do wyciszania ekspresji genów MMP-2 i MMP-9 kodujących metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej w komórkach raka płuca linii A549

• Authors: Anna Galilejczyk , Daniel Sypniewski , Ilona Bednarek

Title variants

EN

Preliminary results of application of RNA interference technique to downregulate expression of matrix metalloproteinases: MMP-2 and MMP-9 genes in A549 lung cancercells

• Languages of publication: PL

Abstracts

PL

W S T Ę P Wzrost guzów nowotworowych, inwazja otaczających tkanek oraz powstawanie przerzutów wymagają degradacji białkowych składników macierzy pozakomórkowej oraz błon podstawnych. Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej odgrywają podstawową rolę w trawieniu składników macierzy i nasilają wiele niekorzystnych zmian w otoczeniu rozwijającego się nowotworu. W przebiegu licznych nowotworów szczególnie podkreśla się negatywną rolę metaloproteinaz należących do grupy żelatynaz. Celem pracy było zaprojektowanie i zastosowanie metody wykorzystującej zjawisko interferencji RNA, pozwalającej obniżyć ekspresję genów MMP-2 i MMP-9. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły ludzkie komórki nowotworowe niedrobnokomórkowego raka płuca linii A549. Wyciszające konstrukcje genetyczne zaprojektowano opierając się na sekwencjach mRNA dla MMP-2 i MMP-9, pochodzących z bazy danych GenBank, za pomocą programu komputerowego sirna, a następnie wklonowano do plazmidu pSUPER.neo. Po zweryfikowaniu prawidłowości otrzymanych konstrukcji, plazmidowy DNA wykorzystano do transfekcji komórek eukariotycznych A549. Do oceny zmian poziomu ekspresji mRNA MMP-2 i MMP-9 zastosowano metodę Real Time TM RT – PCR. WYNIKI W komórkach A549, do których wprowadzono zaprojektowane konstrukcje shRNA/MMP-2, po 24 godzinach nie zaobserwowano zmian poziomu mRNA MMP-2, natomiast po 10 dniach odnotowano 33,1% spadek ekspresji tego genu. Wydajniejszy był proces wyciszania ekspresji genu MMP-9 , gdyż w komórkach transfekowanych plazmidami niosącymi konstrukcje shRNA/MMP-9 zaobserwowano 95,6% spadek liczby kopii mRNA MMP- 9 już po 24 godzinach. Po 10 dniach poziom ekspresji genu MMP-9 wynosił 26,2% w stosunku do poziomu ustalonego dla komórek kontrolnych. WNIOSKI Technika interferencji RNA może być wykorzystywana do wyciszania ekspresji genów żelatynaz związanych z procesem metastazy nowotworów. Wstępne wyniki potwierdziły zdolność zaprojektowanych konstrukcj i genetycznych do potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji tychże genów w komórkach niedrobnokomórkowego raka płuca linii A549

EN

INTRODUCTION Tumor growth, invasion of surrounding tissues and metastasis require degradation of the protein components of the extracellular matrix and basement membranes. Matrix metalloproteinases play a major role in the process of digesting ECM components and intensify the adverse effects around the growing tumor. Increased expression and activity of MMP-2 and MMP-9 have been observed in many malignancies. The aim of this study was to design and apply a method based on RNA interference to reduce the expression of gelatinases. MATERIAL AND METHOD Silencing oligonucleotides directed at MMP-2 and MMP-9 genes were designed based on the mRNA sequences (GenBank) in the sirna program. Gene constructs were synthesized and cloned into the pSUPER.neo vector. After verifying their correctness, plasmid DNA was used to transfect human non-small cell lung cancer A549 cells. The changes in the level of MMP-2 and MMP-9 mRNA were determined by the Real TimeTM PCR technique. RESULTS After 24 hours of shRNA/MMP-2 construct application, no changes in the MMP-2 mRNA level were observed. In turn, after 10 days a 33.1% reduction was noticed. Downregulation of the MMP-9 gene was more efficient. After 24 hours of using plasmids carrying shRNA/MMP-9 constructs, a 95.6% decrease in the number of MMP-9 mRNA copies was observed. After 10 days, the level of MMP-9 gene expression was 26.2% in comparison to the mRNA level established for the control cells. CONCLUSIONS The RNA interference technique can be successfully used to downregulate the expression of MMP-2 and MMP-9 genes. The obtained results confirmed that our shRNA/MMP-2 and shRNA/MMP-9 constructs are capable of reducing the mRNA level in the non–small cell lung cancer A549 cell line.

Keywords

EN

MMP-2; MMP-9; RNA interference; interferencja RNA; niedrobnokomórkowy rak płucaMMP-2; non-small cell lung cancer

Discipline

• MEDICINE: MEDICINE

• Publisher: Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
• Journal: Annales Academiae Medicae Silesiensis
• Year: 2013
• Volume: 67
• Issue: 3
• Pages: 157–165

Contributors

author

Anna Galilejczyk

• Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach ul. Narcyzów 1 41-200 Sosnowiec tel. [phone]

author

Daniel Sypniewski

• Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach

author

Ilona Bednarek

• Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach

References

• 1. Kessenbrock K., Plaks V., Werb Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenviroment. Cell 2010; 141: 52–67.
• 2. Lipka D., Boratyński J. Metaloproteinazy MMP. Struktura i funkcja. Post. Hig. Med. Dośw. 2008; 62: 328–336.
• 3. Gialeli C., Theocharis A.D., Karamanos N.K. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting. FEBS J. 2011; 278: 16–27.
• 4. Folgueras A.R., Pendás A.M., Sánchez L.M., López-Otín C. Matrix metalloproteinases in cancer: from new functions to improved inhibition strategies. Int. J. Dev. Biol. 2004; 48: 411–424.
• 5. Przybyłowska K., Błasiak J. Metaloproteazy macierzowe i ich rola w progresji nowotworów. Post. Bioch. 2001; 47: 212–223.
• 6. Hrabec E., Strek M., Nowak D., Greger J., Suwalski M., Hrabec Z. Activity of type IV collagenases (MMP-2 and MMP-9) in primary pulmonary carcinomas: a quantitative analysis. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2002; 128: 197–204.
• 7. Kopczyńska E., Dancewicz M., Kowalewski J., Kardymowicz H., Tyrakowski T. Stężenie metaloproteinazy 9 i 2 w surowicy chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca. Pol.Merkuriusz Lek. 2007; 132: 539–541.
• 8. Lin P.Y., Yu S.L., Yang P.C. MicroRNA in lung cancer. Br. J. Cancer 2010; 103: 1144–1148.
• 9. Pai S.I., Lin Y.Y., Macaes B., Meneshian A., Hung C.F., Wu T.C. Prospects of RNA interference therapy for cancer. Gene Ther. 2006; 13: 464–477.
• 10. Sierant M., Nawror B. Charakterystyka zjawiska interferencji RNA, podstawy strukturalne i właściwości siRNA. Wiad. Chem. 2003; 57: 569–585.
• 11. Martineau H.M., Pyrah I.T. Review of the Application of RNA Interference Technology in the Pharmaceutical Industry. Toxicol. Pathol. 2007; 35: 327–336.
• 12. Milhavet O., Gary D.S., Mattson M.P. RNA interference in biology and medicine. Pharmacol. Rev. 2003; 55: 629–648.
• 13. Piotrowska A., Rybarczyk A., Wierzbicki P.M., Kotwas M., Wrońska A., Kmieć Z. Interferencja RNA: mechanizm i możliwości terapeutycznego wykorzystania. Pol. Ann. Med. 2009; 16: 138–147.
• 14. Sledz C.A., Williams B.R. RNA interference in biology and disease. Blood 2005; 106: 787–794.
• 15. Deryugina E.I., Quigley J.P. Matrix metalloproteinases and tumor metastasis. Cancer Metastasis Rev. 2006; 25: 9–34.
• 16. Fisher J.F., Mobashery S. Recent advances in MMP inhibitor design. Cancer Metastasis Rev. 2006; 25:115–136.
• 17. Rao D.D., Senzer N., Cleary M.A., Nemunaitis J. Comparative assessment of siRNA and shRNA off target effects: what is slowing clinical development. Cancer Gene. Ther. 2009; 16: 807–809.
• 18. Moore C.B., Guthrie E.H., Huang M.T., Taxman D.J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods Mol. Biol. 2010; 629: 141–158.
• 19. Liu J., Xiong W., Baca-Regen L., Nagase H., Baxter B.T. Mechanism of inhibition of matrix metalloproteinase-2 expression by doxycycline in human aortic smooth muscle cells. J. Vasc. Surg. 2003; 8: 1376–1383.
• 20. Akoolel S., Kleinert H., Hamada F.M. i wsp. Nitric Oxide Increases the Decay of Matrix Metalloproteinase 9 mRNA by Inhibiting the Expression of mRNA-Stabilizing Factor HuR. Mol. Cell Biol. 2003; 23: 4901–4916.
• 21. Shao Y., Chan C.Y., Maliyekkel A., Lawrence C.E., Roninson I.B., Ding Y. Effect of target secondary structure on RNAi efficiency. RNA 2007; 13: 1631–1640.
• 22. Schopman N.C., Liu Y.P., Konstantinova P., ter Brake O., Berkhout B. Optimization of shRNA inhibitors by variation of the terminal loop sequence. Antiviral Res. 2010; 86: 204–211.
• 23. Karube Y, Tanaka H, Osada H i wsp. Reduced expression of Dicer associated with poor prognosis in lung cancer patients. Cancer Sci. 2005; 96: 111–115.
• 24. Hinkal G.W., Grelier G., Puisieux A., Moyret-Lalle C. Complexity in the regulation of Dicer expression: Dicer variant proteins are differentially expressed in epithelial and mesenchymal breast cancer cells and decreased during EMT. Br. J. Cancer 2011; 104: 387–388.
• 25. Zhi Y.H., Song M.M., Wang P.L., Zhang T., Yin Z.Y. Suppression of matrix metalloproteinase-2 via RNA interference inhibits pancreatic carcinoma cell invasiveness and adhesion. World J. Gastroenterol. 2009; 15: 1072–1078.
• 26. Chetty C., Bhoopathi P., Joseph P., Chittivelu S., Rao J.S., Lakka S. Adenovirus-mediated small interfering RNA against matrix metallo-proteinase-2 suppresses tumor growth and lung metastasis in mice. Mol. Cancer Ther. 2006; 5: 2289–2299.

• Document Type: article