Search results

Search:
in the keywords: interferencja RNA

Sort By:

Limit search:

Wstępne wyniki zastosowania techniki interferencji RNA do wyciszania ekspresji genów MMP-2 i MMP-9 kodujących metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej w komórkach raka płuca linii A549

100%

Galilejczyk A., Sypniewski D., Bednarek I.

Annales Academiae Medicae Silesiensis

2013

vol. 67

issue 3

157-165

INTRODUCTION Tumor growth, invasion of surrounding tissues and metastasis require degradation of the protein components of the extracellular matrix and basement membranes. Matrix metalloproteinases play a major role in the process of digesting ECM components and intensify the adverse effects around the growing tumor. Increased expression and activity of MMP-2 and MMP-9 have been observed in many malignancies. The aim of this study was to design and apply a method based on RNA interference to reduce the expression of gelatinases. MATERIAL AND METHOD Silencing oligonucleotides directed at MMP-2 and MMP-9 genes were designed based on the mRNA sequences (GenBank) in the sirna program. Gene constructs were synthesized and cloned into the pSUPER.neo vector. After verifying their correctness, plasmid DNA was used to transfect human non-small cell lung cancer A549 cells. The changes in the level of MMP-2 and MMP-9 mRNA were determined by the Real TimeTM PCR technique. RESULTS After 24 hours of shRNA/MMP-2 construct application, no changes in the MMP-2 mRNA level were observed. In turn, after 10 days a 33.1% reduction was noticed. Downregulation of the MMP-9 gene was more efficient. After 24 hours of using plasmids carrying shRNA/MMP-9 constructs, a 95.6% decrease in the number of MMP-9 mRNA copies was observed. After 10 days, the level of MMP-9 gene expression was 26.2% in comparison to the mRNA level established for the control cells. CONCLUSIONS The RNA interference technique can be successfully used to downregulate the expression of MMP-2 and MMP-9 genes. The obtained results confirmed that our shRNA/MMP-2 and shRNA/MMP-9 constructs are capable of reducing the mRNA level in the non–small cell lung cancer A549 cell line.

W S T Ę P Wzrost guzów nowotworowych, inwazja otaczających tkanek oraz powstawanie przerzutów wymagają degradacji białkowych składników macierzy pozakomórkowej oraz błon podstawnych. Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej odgrywają podstawową rolę w trawieniu składników macierzy i nasilają wiele niekorzystnych zmian w otoczeniu rozwijającego się nowotworu. W przebiegu licznych nowotworów szczególnie podkreśla się negatywną rolę metaloproteinaz należących do grupy żelatynaz. Celem pracy było zaprojektowanie i zastosowanie metody wykorzystującej zjawisko interferencji RNA, pozwalającej obniżyć ekspresję genów MMP-2 i MMP-9. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły ludzkie komórki nowotworowe niedrobnokomórkowego raka płuca linii A549. Wyciszające konstrukcje genetyczne zaprojektowano opierając się na sekwencjach mRNA dla MMP-2 i MMP-9, pochodzących z bazy danych GenBank, za pomocą programu komputerowego sirna, a następnie wklonowano do plazmidu pSUPER.neo. Po zweryfikowaniu prawidłowości otrzymanych konstrukcji, plazmidowy DNA wykorzystano do transfekcji komórek eukariotycznych A549. Do oceny zmian poziomu ekspresji mRNA MMP-2 i MMP-9 zastosowano metodę Real Time TM RT – PCR. WYNIKI W komórkach A549, do których wprowadzono zaprojektowane konstrukcje shRNA/MMP-2, po 24 godzinach nie zaobserwowano zmian poziomu mRNA MMP-2, natomiast po 10 dniach odnotowano 33,1% spadek ekspresji tego genu. Wydajniejszy był proces wyciszania ekspresji genu MMP-9 , gdyż w komórkach transfekowanych plazmidami niosącymi konstrukcje shRNA/MMP-9 zaobserwowano 95,6% spadek liczby kopii mRNA MMP- 9 już po 24 godzinach. Po 10 dniach poziom ekspresji genu MMP-9 wynosił 26,2% w stosunku do poziomu ustalonego dla komórek kontrolnych. WNIOSKI Technika interferencji RNA może być wykorzystywana do wyciszania ekspresji genów żelatynaz związanych z procesem metastazy nowotworów. Wstępne wyniki potwierdziły zdolność zaprojektowanych konstrukcj i genetycznych do potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji tychże genów w komórkach niedrobnokomórkowego raka płuca linii A549

STAT3 – ukryty czynnik transkrypcyjny celem terapii przeciwnowotworowych

67%

Poczęta M., Bednarek I.

Annales Academiae Medicae Silesiensis

2013

vol. 67

issue 2

133-141

STAT proteins belong to the transcriptional factors family, and each of them performs a unique function in extracellular signal transduction and in direct regulation of transcription. Their function is based on controlling genes expression, which is involved in cell survival, proliferation, chemoresistance and angiogenesis. Phosphorylated STAT3 is observed in 70% of human cancers. STAT3 as an oncogenic protein is constitutively activated in many primary human cancers by different cytokines as: IL-6 IL-7, IL-10, IL-20, leptin, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and oncogenic proteins such as Src and Ras. Moreover, STAT3 can be activated by receptor and nonreceptor tyrosine kinases such as: epidermal growth factor receptor kinase (EGFR), activated Janus kinase (JAK) or kinase regulating extracellular signals (ERK). An important role of STAT3 is the regulation of cancer cells autonomous properties. The blocking of STAT3 expression in human cancer cells inhibits proliferation in vitro and cancer progression in vivo. To inhibit gene expression of STAT3, antisense oligonucleotides, rybozimes and DNAzymes can be used. The STAT3 protein can be blocked by tyrosine kinase inhibitors, negative dominants for the STAT3 protein, complementary to small nonpeptide particle drugs. Among the newest methods of gene expression regulation is the RNA – RNAi method of interference.

Białka STAT (signal transducer and activator of transcription – przekaźnik sygnału i aktywator transkrypcji) to rodzina czynników transkrypcyjnych, z których każdy pełni unikalną funkcję w przekazywaniu sygnałów zewnątrzko-mórkowych oraz bezpośrednim regulowaniu transkrypcji. Ich funkcja polega na kontroli ekspresji genów, które zaangażowane są w przeżycie komórek, proliferację, chemiooporność oraz angiogenezę. Ufosforylowany STAT3 obserwuje się w blisko 70% ludzkich nowotworów. Pełniąc rolę białka onkogennego ulega on konstytutywnej aktywacji w wielu pierwotnych nowotworach u ludzi, będąc aktywowanym przez wiele różnych cytokin, takich jak IL-6 IL-7, IL-10, IL-20, leptyna, czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów (granulocyte colony stimulating factor – G-CSF), epidermalny czynnik wzrostu (epidermal growth factor – EGF), płytkowy czynnik wzrostu (platelet-derived growth factor – PDGF), a także białka onkogenne, m.in. Src i Ras. Ponadto STAT3 może być aktywowany poprzez receptorowe i niereceptorowe kinazy tyrozynowe, takie jak: kinaza receptora epidermalnego czynnika wzrostu (kinase of epidermal growth factor receptor – EGFR), aktywowana kinaza Janus (activated Janus kinase – JAK), kinazy regulujące sygnały zewnątrzkomórkowe (kinases regulating extracellular signals – ERK). Jego istotną funkcją jest regulacja autonomicznych właściwości komórek nowotworowych. Blokowanie ekspresji STAT3 w ludzkich komórkach nowotworowych hamuje proliferację in vitro oraz progresję nowotworów in vivo. W celu wyciszenia ekspresji genów STAT3 można wykorzystać oligonukleotydy antysensowe, rybozymy i DNAzymy. Samo białko STAT3 można zablokować wykorzystując inhibitory kinazy tyrozynowej, dominanty negatywne wobec białka STAT3, komplementarne wobec leków małe niepeptydowe cząsteczki. Wśród najnowszych metod regulacji ekspresji genów znajduje się metoda wykorzystująca proces interferencji RNA – RNAi.

Refine search results

2 Annales Academiae Medicae Silesiensis

2 2013

2 Bednarek I.

1 Galilejczyk A.

1 Poczęta M.

1 Sypniewski D.

Search results

Wstępne wyniki zastosowania techniki interferencji RNA do wyciszania ekspresji genów MMP-2 i MMP-9 kodujących metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej w komórkach raka płuca linii A549

STAT3 – ukryty czynnik transkrypcyjny celem terapii przeciwnowotworowych