INTRODUCTION Tumor growth, invasion of surrounding tissues and metastasis require degradation of the protein components of the extracellular matrix and basement membranes. Matrix metalloproteinases play a major role in the process of digesting ECM components and intensify the adverse effects around the growing tumor. Increased expression and activity of MMP-2 and MMP-9 have been observed in many malignancies. The aim of this study was to design and apply a method based on RNA interference to reduce the expression of gelatinases. MATERIAL AND METHOD Silencing oligonucleotides directed at MMP-2 and MMP-9 genes were designed based on the mRNA sequences (GenBank) in the sirna program. Gene constructs were synthesized and cloned into the pSUPER.neo vector. After verifying their correctness, plasmid DNA was used to transfect human non-small cell lung cancer A549 cells. The changes in the level of MMP-2 and MMP-9 mRNA were determined by the Real TimeTM PCR technique. RESULTS After 24 hours of shRNA/MMP-2 construct application, no changes in the MMP-2 mRNA level were observed. In turn, after 10 days a 33.1% reduction was noticed. Downregulation of the MMP-9 gene was more efficient. After 24 hours of using plasmids carrying shRNA/MMP-9 constructs, a 95.6% decrease in the number of MMP-9 mRNA copies was observed. After 10 days, the level of MMP-9 gene expression was 26.2% in comparison to the mRNA level established for the control cells. CONCLUSIONS The RNA interference technique can be successfully used to downregulate the expression of MMP-2 and MMP-9 genes. The obtained results confirmed that our shRNA/MMP-2 and shRNA/MMP-9 constructs are capable of reducing the mRNA level in the non–small cell lung cancer A549 cell line.
PL
W S T Ę P Wzrost guzów nowotworowych, inwazja otaczających tkanek oraz powstawanie przerzutów wymagają degradacji białkowych składników macierzy pozakomórkowej oraz błon podstawnych. Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej odgrywają podstawową rolę w trawieniu składników macierzy i nasilają wiele niekorzystnych zmian w otoczeniu rozwijającego się nowotworu. W przebiegu licznych nowotworów szczególnie podkreśla się negatywną rolę metaloproteinaz należących do grupy żelatynaz. Celem pracy było zaprojektowanie i zastosowanie metody wykorzystującej zjawisko interferencji RNA, pozwalającej obniżyć ekspresję genów MMP-2 i MMP-9. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły ludzkie komórki nowotworowe niedrobnokomórkowego raka płuca linii A549. Wyciszające konstrukcje genetyczne zaprojektowano opierając się na sekwencjach mRNA dla MMP-2 i MMP-9, pochodzących z bazy danych GenBank, za pomocą programu komputerowego sirna, a następnie wklonowano do plazmidu pSUPER.neo. Po zweryfikowaniu prawidłowości otrzymanych konstrukcji, plazmidowy DNA wykorzystano do transfekcji komórek eukariotycznych A549. Do oceny zmian poziomu ekspresji mRNA MMP-2 i MMP-9 zastosowano metodę Real Time TM RT – PCR. WYNIKI W komórkach A549, do których wprowadzono zaprojektowane konstrukcje shRNA/MMP-2, po 24 godzinach nie zaobserwowano zmian poziomu mRNA MMP-2, natomiast po 10 dniach odnotowano 33,1% spadek ekspresji tego genu. Wydajniejszy był proces wyciszania ekspresji genu MMP-9 , gdyż w komórkach transfekowanych plazmidami niosącymi konstrukcje shRNA/MMP-9 zaobserwowano 95,6% spadek liczby kopii mRNA MMP- 9 już po 24 godzinach. Po 10 dniach poziom ekspresji genu MMP-9 wynosił 26,2% w stosunku do poziomu ustalonego dla komórek kontrolnych. WNIOSKI Technika interferencji RNA może być wykorzystywana do wyciszania ekspresji genów żelatynaz związanych z procesem metastazy nowotworów. Wstępne wyniki potwierdziły zdolność zaprojektowanych konstrukcj i genetycznych do potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji tychże genów w komórkach niedrobnokomórkowego raka płuca linii A549
In recent years intensive research has been dedicated to the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) due to its significant role in the pathogenesis of malignant tumors. In many types of cancers intracellular pathways modulated by EGFR have been identified as crucial factors influencing tumor survival and development. On the other hand, EGFR has also been shown to be a promising molecular target for potential therapeutic agents. Attempts to modify the signal transduction exerted by EGF have been made either by blocking the activity of certain elements of the EGFR pathway or by direct inhibition of the EGF receptor itself. It has also been demonstrated that the use of monoclonal antibodies to block the EGF receptor increases the effectiveness of conventional anticancer agents such as cisplatin. Thus, many anticancer therapies based on inhibitors of the selected components of the EGFR signaling pathway have been established, and many of them apply monoclonal antibodies.
PL
Receptor naskórkowego czynnika wzrostu EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), ze względu na jego ważny udział w patogenezie nowotworów złośliwych, jest obiektem intensywnych badań naukowych ostatnich lat. W wielu typach nowotworów wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne pobudzane przez EGFR mają wręcz kluczowe znaczenie w ich rozwoju. Z drugiej strony wykazano, iż EGFR może stanowić bardzo obiecujący punkt uchwytu dla czynników terapeutycznych. Podjęto próby modyfikacji transdukcji sygnału przekazywanego przez aktywny EGFR wewnątrz komórek poprzez blokowanie aktywności elementów tego szlaku bądź samego receptora. Wykazano też, że blokowanie receptora EGFR przez przeciwciała monoklonalne podwyższa efektywność stosowanych w terapii kon-wencjonalnych czynników przeciwnowotworowych, np. cisplatyny. Dodatkowo opracowano wiele terapii przeciwno-wotworowych opierając się na zastosowaniu inhibitorów wybranych, kluczowych składowych szlaku sygnalizacyj-nego EGFR, z których wiele bazuje na zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych.
JavaScript is turned off in your web browser. Turn it on to take full advantage of this site, then refresh the page.