Zastosowanie metod PCR i FISH w szybkiej diagnostyce bakteryjnych zakażeń krwi

• Authors: Tomasz Gosiewski , Agata Pietrzyk , Monika Brzychczy-Włoch , Piotr B. Heczko

Title variants

EN

Use of PCR and FISH methods for rapid identifi cation of bacterial bloodstream infections

• Languages of publication: PL

Abstracts

PL

WSTĘP Celem pracy była ocena możliwości zastosowania metod PCR i FISH w szybkiej diagnostyce bakteryjnych zakażeń krwi. MATERIAŁ I METODY Analizie poddano 56 próbek: 28 próbek krwi żylnej i 28 próbek podłoży hodowlanych. Wszystkie próbki krwi pochodziły od pacjentów z klinicznymi objawami sepsy, diagnozowanych w Pracowni Diagnostyki Mikrobiologicznej Katedry Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Pobrane próbki krwi badano na obecność bakterii, równolegle w systemie hodowli monitorowanej BACTEC oraz za pomocą metod PCR (polymerase chain reaction) i FISH (fl uorescent in situ hydridization). Dodatkowo, każdą butelkę z podłożem poddawano analizie za pomocą metody FISH. Izolację DNA prowadzono przy użyciu zestawu QIAamp DNA Blood Mini. W celu usunięcia inhibitorów PCR wprowadzono etap oczyszczania próbek chlorkiem amonu. Do reakcji PCR wykorzystano parę starterów 16SrRNA(+) i 16SrRNA(-) umożliwiającą wykrycie wszystkich gatunków bakterii. W metodzie FISH wykorzystano sondę EUB338 swoistą dla wszystkich gatunków bakterii oraz sondy swoiste dla Enterobacteriaceae (ENT183) i rodzaju Staphylococcus (STA). WYNIKI Odsetek wyników dodatnich dla próbek krwi żylnej wynosił: 71,4%, 28,6% i 10,7% odpowiednio dla PCR, FISH i BACTEC. Różnice między wynikami uzyskanymi za pomocą metod PCR i FISH oraz PCR i BACTEC były statystycznie istotne. W przypadku analizy próbek podłóż hodowlanych, odsetek wyników dodatnich dla metody FISH wynosił 58,3%, natomiast dla metody hodowlanej 33,3%. Różnica ta nie była statystycznie istotna. Czas potrzebny do uzyskania wyników badań prowadzonych za pomocą metod PCR i FISH wynosił około 4–5 godzin. Amplifikacja DNA była możliwa jedynie dla próbek krwi poddanych dodatkowo wstępnej procedurze oczyszczania i przepłukiwania osadu komórkowego. W pozostałych przypadkach obserwowano efekt inhibicji. WNIOSKI Uzyskane wyniki wykazały, że metody PCR i FISH pozwalają na wykrycie obecności bakterii w próbkach pełnej krwi, są bardziej czułe od metody hodowlanej, skracają czas oczekiwania na wynik do kilku godzin, zaś reakcja amplifi kacji wymaga zastosowania dodatkowej procedury oczyszczania próbek krwi.

EN

INTRODUCTION The aim of this study was to evaluate the possibility of applying PCR and FISH methods in rapid diagnostics of bacterial bloodstream infections. MATERIAL AND METHODS 56 samples: 28 venous blood samples and 28 samples of culture media from BACTEC machine after incubation cycle were tested. All blood samples originated from patients with clinical symptoms of sepsis who were diagnosed in the Laboratory of Microbiological Diagnostics at the Chair of Microbiology Medical College Jagiellonian University in Krakow. The blood samples were tested to presence of bacteria in parallel, using PCR, FISH and culture monitored BACTEC system. Additionally, each bottle with medium was analyzed by FISH method. DNA was extracted with QIAamp DNA Blood Mini (Qiagen). To remove PCR inhibitors the step of samples purifi cation with ammonium chloride was added. For PCR reaction a pair of 16SrRNA(+) and 16SrRNA(-) starters which enables detection of all bacteria species was applied. In FISH method a probe specifi c to all bacteria species EUB338 and probes specifi c to Enterobacteriaceae (ENT183) and Staphylococcus genus (STA) were used. RESULTS Percentage of positive venous blood samples for PCR, FISH and BACTEC was: 71.4%, 28.6% and 10.7%, respectively. The diff erences between results obtained by PCR and FISH methods and by PCR and BACTEC were statistically signifi cant. In case of culture media samples analysis a percentage of positive results for FISH was 58.3%, while for culture method 33.3%. This diff erence was not statistically signifi cant. The time needed to receive a results of samples examination using PCR and FISH methods was about 4–5 hours. DNA amplifi cation was obtainable only for these blood samples which were in addition initially purifi ed, and special cellular sediment washing procedure was used. For unpurifi ed samples inhibition eff ect was noted. Conclusions Results obtained by us indicated that PCR and FISH methods: allow to detect bacteria in whole blood samples, are much more sensitive than culture method, shorten waiting time for results to few hours and that the use of additional procedure of blood samples purifi cation is needed to receive a positive result of amplifi cation.

Keywords

EN

FISH; PCR; PCR inhibition; blood culture; diagnostics of sepsis; diagnostyka sepsy; hodowla krwi; inhibicja PCR

Discipline

• MEDICINE: MEDICINE

• Publisher: Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
• Journal: Annales Academiae Medicae Silesiensis
• Year: 2011
• Volume: 65
• Issue: 5-6
• Pages: 14–22

Contributors

author

Tomasz Gosiewski

• Katedra Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego ul. Czysta 18 31-121 Kraków tel. [phone] w 225; fax [phone]

author

Agata Pietrzyk

• Katedra Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie

author

Monika Brzychczy-Włoch

• Katedra Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie

author

Piotr B. Heczko

• Katedra Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie

References

• 1. Lever A., Mackenzie I., Sepsis: defi nition, epidemiology and diagnosis. Clinic. Rev. 2008; 335(27): 879–883.
• 2. Martin G.S., Mannino D.M., Moss M. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000. N. Engl. J. Med. 2003; 348: 1546–1554.
• 3. Baltimore R.S. Neonatal sepsis: epidemiology and managment. Paediatr. Drugs 2003; 5: 723–740.
• 4. Watson R.S., Carcillo J.A. Scope and epidemiology of pediatric sepsis. Pediatr. Crit. Care Med. 2005; 6: 3–5.
• 5. Zieliński A., Czarkowski M.P. Choroby zakaźne w Polsce w 2005 roku. Przegl. Epidemiol. 2007; 61: 177–187.
• 6. Williams M.D., Braun L.A., Cooper L.M., i wsp. Hospitalized cancer patients with severe sepsis: analysis of incidence, mortality and associated costs of care. Crit. Care 2004; 8: 291–298.
• 7. Jamal W., Tamaray G., Pazhoor A., Rotimi V.O. Comparative evaluation of BacT/ALERT 3D and BACTEC systems for the recovery of pathogens causing bloodstream infections. Med. Princ. Pract. 2006; 15: 223–227.
• 8. Alexander B.D. Diagnosis of fungal infection: new technologies for the mycology laboratory. Transpl. Infect. Dis. 2004; 4: 32–37.
• 9. Romaschin A.D., Harris D.M., Ribeiro M.B. i wsp. A rapid assay of endotoxin in whole blood using autologous neutrophil dependent chemiluminescence. J. Immunol. Methods 1998; 121: 169–185.
• 10. Klouche M., Schroder U. Rapid methods for diagnosis of bloodstream infections. Clin. Chem. Lab. Med. 2008; 46: 888–908.
• 11. Abu Al-Soud P., Randstrom P. Purifi cation and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clinic. Microbiol. 2001; 39: 485–493.
• 12. Akane A., Matsubara K., Nakamura H. Identifi cation of the heme compound copurifi ed with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains a major inhibitor of polymerase chain reaction amplifi cation. J. Forensic. Sci. 1994; 37: 362–372.
• 13. Hryniewiecki T., Gzyl A., Augustynowicz E., Rawaczyńska I. Reakcja amplifi kacji bakteryjnego DNA w diagnostyce infekcyjnego zapalenia wsierdzia. Med. Dosw. Mikrobiol. 2002; 54: 265–272.
• 14. Kane T., Johannigman J. The Detection of Microbial DNA in the Blood. Ann. Surg. 1998; 1: 1–9.
• 15. Urakawa H., Noble P.A., Fantroussi S.E. Kelly J.J., Stahl D.A. Single-base-pair discrimination of terminal mismatches by using oligonucleotide microarrays and neural network analyses. Appl. Envir. Microbiol. 2002; 68: 235–244.
• 16. Friedrich U., Van Langenhove H., Altendorf K. Lipski A. Microbial community and physicochemical analysis of an industrial waste gas biofi lter and design of 16S rRNA-targeting oligonucleotide probes. Environ. Microbiol. 2003; 5: 183–201.
• 17. Amann R.I., Binder B.J., Olson R.J., Chisholm S.W., Devereux R., Stahl D.A. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with fl ow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl. Environ. Microbiol. 1990; 56: 1919–1925.
• 18. Abu Al-Soud W., Rĺdström P. Capacity of Nine Thermostable DNA Polymerases To Mediate DNA Amplifi cation in the Presence of PCR – Inhibiting Samples. Appl. Environ. Microbiol. 1998; 64: 3748–3753.
• 19. Banas B., Kost B.P., Goebel F.D. Platelets, a typical source of error in real-time PCR quantifi cation of mitochondrial DNA content in human peripheral blood cells. Eur. J. Med. Res. 2004; 9: 371–377.
• 20. Kreader C. Relief of Amplifi cation Inhibition in PCR with Bovine Serum Albumin or T4 Gene 32 Protein. Appl. Environ. Microbiol. 1996; 62: 1102–1106.
• 21. Rĺdström P., Abu Al-Soud P., Lantz P. A sample preparation method which facilitates detection of bacteria in blood cultures by the polymerase chain reaction. J. Microbiol. Methods 1998; 21: 217–224.
• 22. Michael D., Braida., Laura M., i wsp. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical fl occulation. J. Microbiol. Methods 2003; 52: 389–393.
• 23. Gescher D.M., Kovacevic D., Schmiedel D. i wsp. Fluorescence in situ hybridisation (FISH) accelerates identifi cation of Gram-positive cocci in positive blood cultures. Int. J. Antimicrob. Agents 2008; 19: 51–59.
• 24. Forrest G.N., Mehta S., Weekes E. i wsp. Impact of rapid in situ hybridization testing on coagulase-negative staphylococci positive blood cultures. J. Antimicrob. Chemother. 2006; 58: 154–158.

• Document Type: article